实验准备：wako质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061

单位定义

俄罗斯专享会284中使用的酰胺酶单位被定义为在30℃、pH 9.5条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯胺所需的酶量。单位计算公式为：
AU/vial = [(a-b)/25] × (1/962) × (40/01)
其中，a为样品吸光度，b为空白对照吸光度。

实验操作流程

在实验中，应使用聚硅酮处理的微量离心管和吸管，以避免与蛋白质的接触。建议使用专为质谱分析设计的凝胶染色试剂盒，例如银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）。以下是详细步骤：

1. 对蛋白质样品进行电泳分离。
2. 切割电泳后的蛋白质片段并放入微量离心管。
3. 使用凝胶脱色液进行脱色处理。
4. 向试管中添加300μL乙醇，搅拌并振荡30分钟。
5. 去除乙醇并用Parafilm膜覆盖微量离心管。
6. 在Parafilm膜上打孔并进行真空干燥15分钟。
7. 将100μL 10mmol/L DTT溶解于100mmol/L碳酸氢铵中，56℃恒温1小时。
8. 室温冷却后，加入等量的50mM碘乙酰胺于100mmol/L碳酸氢铵中，避光恒温45分钟并涡旋。
9. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵洗涤凝胶片段10分钟。
10. 用300μL乙醇干燥凝胶片段15分钟。
11. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵使凝胶片段膨胀15分钟。
12. 再次用300μL乙醇干燥凝胶片段15分钟。
13. 去除液相并进行真空干燥15分钟。
14. 用100μL赖氨酸内切酶溶液在冰水浴中使凝胶片段膨胀45分钟。
15. 去除100μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段在37℃、10μL 50mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)中储存过夜。
16. 加入50μL 20mmol/L碳酸氢铵，振荡凝胶片段3次以提取多肽，持续20分钟。
17. 用5%甲酸/50%乙醇再次提取多肽，振荡3次，持续20分钟。
18. 如有需要，可使用SpeedVac浓缩多肽。
19. 使用ZipTip进行多肽的脱盐和纯化。
20. 如有需要，使用低真空浓缩多肽至2μL。
21. 最后加入基质以进行质谱分析。

购买渠道

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