mRNA技术如今已成为一种新兴的生物医疗技术，展现出巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这一技术为疾病的预防与治疗开辟了全新的思路。然而，mRNA技术的发展过程中并非一帆风顺，其中最大的挑战之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的生成。作为一种免疫刺激分子，dsRNA会引发机体的免疫反应，从而严重影响mRNA的安全性与有效性。因此，减少dsRNA的生成已成为mRNA研发领域亟待解决的关键难题。

传统的解决方案通常依赖复杂的纯化工艺，但其成本高昂且效率低下，难以彻底消除微量的dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）的核心工具酶，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性（如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA生成的重要因素。因此，通过定向进化和理性设计来改造T7RNAP，成为全球科研团队竞相探索的热门方向。

在2024年3月3日，我们团队在《FEBS Journal》上发表了题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。我们成功地工程化改造了T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成（仅为野生型的18%），同时大幅提升了合成mRNA的整体效率和质量，这一突破性进展有望推动基因治疗与疫苗开发领域的迅速发展。

我们创新性地结合定向进化与半理性设计的方法，筛选出多个高效低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA生成方面表现出色。我们构建了一个随机突变库，并设计了一种可实时监测液滴内RNA产物的完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，利用荧光激活液滴分选（FADS）定向进化技术进行超高通量筛选。最终，我们筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），其dsRNA含量显著低于野生型。

此外，通过半理性设计，我们构建了十个单点饱和突变库，并利用微孔板筛选技术识别有益的突变体。通过超过1000个突变体的筛选，我们发现了关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q），它们的dsRNA含量显著低于野生型，同时未影响转录效率。

为了进一步优化这些突变体，我们针对上述突变位点构建了DNA重组文库，并通过微孔板筛选，最终获得了组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中的dsRNA含量仅为0.007ng/μg。这一结果不仅在体外实验中得到了验证，同时在细胞实验中也断然降低了免疫原性并提升了蛋白翻译效率。我们将突变体转录的mRNA导入RAW2647细胞后，最优突变体M11产物导致的干扰素β（IFN-β）mRNA和蛋白的表达量分别为野生型的97%和1293pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA导致的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA的生成可以有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA的治疗潜力。

为了深入理解突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验，揭示了这些突变体因降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性而导致dsRNA减少。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论基础。

本研究为T7RNAP的改造提供了新方法与思路，也为mRNA技术的发展注入了新活力。通过减少dsRNA的生成，提高了mRNA的质量和安全性。基于这一研究成果，我们成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNAPolymerase GMP-grade（low dsRNA, 250U/μL））。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的蓬勃发展，为生物医学领域带来更多可能性。

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