邻近连接技术（Proximity Ligation Assay，PLA）是一项极具灵敏度的分子检测方法，可用于在单细胞层面上可视化蛋白质间的相互作用。该技术通过特异性抗体识别并结合目标蛋白，再利用含有寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的PLA探针来识别以及结合一抗。当两个目标蛋白接近时，PLA探针上的DNA会配对形成互补结构，随后在连接酶的作用下，这些DNA片段被连接成环状结构，通过滚环扩增（RCA）产生可检测的信号。PLA技术依赖于亲和探针在近距离（<40nm）识别目标分子，将蛋白质检测转化为DNA核酸序列检测，从而实现对特定蛋白质的检测、定量和定位。

与传统的Co-IP技术相比，PLA技术能够揭示蛋白质相互作用所在的细胞区域，并能够与病理技术结合，观察特定细胞内的蛋白互作情况。通过荧光强度反映互作强弱，实现了蛋白互作的真实可视化。

PLA实验流程一般包括以下几个步骤：

1. 样本处理：使用多聚甲醛对细胞爬片进行固定，而组织样本则需经过石蜡包埋及切片去除蜡质处理。
2. 封闭处理：向细胞爬片或组织切片上均匀添加封闭液，确保其覆盖整个实验区域。
3. 孵育一抗：将稀释的一抗均匀滴加于已封闭的样本上，放入湿盒中于37°C孵育，确保一抗与抗原充分结合。
4. 孵育PLA探针：清洗样本后加入两种PLA探针（PLUS和MINUS）。
5. 连接反应：添加连接缓冲液（含连接酶），并将载玻片置于预热的湿盒中进行37°C的连接反应。
6. 扩增与成像：清洗掉连接缓冲液后，加入含聚合酶的扩增缓冲液，并使用荧光显微镜观察蛋白间的相互作用。

PLA在蛋白互作研究中的应用上，结合抗体的特异性和PCR的高灵敏度，PLA能够敏锐地检测蛋白相互作用。例如，有研究发现Jurkat细胞中的ZAP-70和TCRzeta蛋白主要在细胞质中互作，通过这项研究进一步理解了细胞信号传导机制。

PLA在组织样本中的应用同样令人瞩目。以帕金森疾病为例，LRRK2激酶在该病理状态中的重要性日益凸显。研究者在大鼠脑组织中利用PLA技术探讨LRRK2与pS1292蛋白的互作，发现两者在多巴胺神经元中存在显著的相互作用，其研究结果为疾病的机制提供了新视角。

PLA还可应用于蛋白与RNA的互作研究。例如，在一项研究中，研究人员探讨了FXR1蛋白如何与cMYC mRNA的不同区段结合，证明了PLA技术的多样性与灵活性。

总之，邻近连接技术（PLA）作为一种高灵敏、高特异性的蛋白互作检测技术，展现出广泛的应用前景。在生物医学领域，PLA技术不仅可用于微量样本的微弱互作检测、单细胞水平的蛋白互作与翻译后修饰研究、疾病标志物的发现，还可以助力药物筛选等。随着技术的不断进步，PLA将在更多领域发挥其重要作用，为生物医学研究带来突破性进展。

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